公共數據揭示小麥Bax抑制劑-1蛋白(BI-1)與水通道蛋白TaPIP1相互作用增強擬南芥抗病性

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摘要
Bax抑制劑-1(BI-1)是真核生物中進化保守的內質網(ER),定位細胞死亡抑制因子。 BI-1抑制生物和非生物脅迫的能力在擬南芥中得到了充分研究,而小麥中BI-1的功能在很大程度上是未知的。在這項研究中,將禾谷鐮刀菌(Fg)處理的小麥進行RNA-seq分析,然后分離小麥BI-1基因TaBI-1.1。通過水楊酸(SA)處理誘導TaBI-1.1表達,并通過脫落酸(ABA)處理誘導TaBI-1.1的下調?;訐?葡糖醛酸糖苷酶(GUS)染色,TaBI-1.1在成熟葉和根中表達,但不在下胚軸或幼葉中表達。 TaBI-1.1在擬南芥中的組成型表達增強了其對丁香假單胞菌病毒(Pst)DC3000感染的抗性并誘導SA相關基因表達。此外,TaBI-1.1轉基因擬南芥顯示出由高濃度SA引起的損害的減輕,并降低了對ABA的敏感性。與表型一致,35S :: TaBI-1.1和Col-0植物的RNA-seq分析顯示TaBI-1.1參與生物脅迫。這些結果表明,TaBI-1.1正向調節SA信號并在對生物脅迫的響應中起重要作用。此外,TaBI-1.1與水通道蛋白TaPIP1相互作用,并且它們都定位于ER膜(內質網膜)。此外,研究人員證明了SA處理后TaPIP1上調,并且TaPIP1轉基因擬南芥增強了對Pst DC3000感染的抗性。由此表明,在ER膜上TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用可能發生在對SA信號和防御反應的響應中。

材料和方法

使用擬南芥Columbia-0(Col-0)作為TaBI-1.1過表達的背景, 突變體atbi1-2從擬南芥生物資源中心(ABRC)獲得。 從栽培的小麥品種小白麥擴增TaBI-1.1和TaPIP1的cDNA, 將PCR產物克隆到pLB載體中,使用DNAMAN 6.0軟件進行氨基酸序列同一性比較。
RNA-Seq Analysis
收集來自4周齡Col-0和轉基因系35S :: TaBI-1.1的葉片用于RNA-seq分析,使用HiSeq 2500平臺測序。測序數據與TAIR 10擬南芥參考基因組比對。使用TopHat和Cufflink軟件包進行mRNAseq數據分析以及DEG的鑒定和分析。通過GOseq軟件進行差異表達基因的GO富集分析。根據KEGG數據庫通路進行KEGG富集分析,尋找差異表達基因的富集通路。在百邁客云平臺(BMKCloud)完成小麥Fg處理的RNA-seq數據下載和分析, SRA數據庫(登錄號:PRJNA289545)。
其他實驗:1.qRT-PCR分析;2.轉基因擬南芥植株在脅迫處理下的應答及性狀評價;3.β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)活性測定;4.細菌接種和細菌生長的監測;5.酵母雙雜交系統;6.Pull-Down assay(免疫沉淀法);7.亞細胞定位測定;8.ELISA Assay(酶聯免疫吸附試驗)

分析結果
1.通過qRT-PCR和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)染色確定TaBI-1.1的表達模式
研究人員分析了來自Fg處理的小麥RNA-seq數據,以研究植物防御信號通路。從RNA-seq分析中分離出前10個差異表達基因。在這10個基因中鑒定了兩個小麥BI-1基因:TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980。 TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980在之前的研究中被命名為TaBI-1。在小麥Ensembl數據庫中僅篩選出三種BI-1基因:TaBI-1,TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_488014_AA1573990。在兩個差異表達的BI-1基因中, TaBI-1.1的差異最大。根據氨基酸比對,TaBI-1.1與TaBI-1同一性達到99.19%。與對照相比,Fg處理對TaBI-1.1的表達水平上調24倍。許多關于AtBI-1的研究已經證實AtBI-1在植物中對生物和非生物脅迫的抗性中起關鍵作用。 TaBI-1.1蛋白的序列與AtBI-1有69.88%的同一性,表明該序列在BI-1家族中基本保守。使用qRT-PCR監測TaBI-1.1的表達模式以確定TaBI-1.1在生物和非生物脅迫中可能的作用。TaBI-1.1的表達在響應SA處理時顯著上調,在響應ABA處理時下調。 SA處理48小時后TaBI-1.1表達達到8倍高峰(圖1A)。 響應ABA處理的下調水平在8小時達到初始水平的約1/5(圖1C)。 響應NaCl處理,表達水平在4小時后下降,在2小時稍微增加并且在8小時后回到其初始水平(圖1B)。
研究者創建了含有1.7kb TaBI-1.1啟動子并生成轉基因擬南芥的PBI :: GUS融合構建體,以研究TaBI-1.1的空間表達模式。使用GUS染色測定組織GUS活性。在成熟葉和根中有TaBI-1.1表達,但在下胚軸和幼葉中觀察不到(圖1D)?;辜觳飭爍髦中÷笞櫓械腡aBI-1.1表達水平,包括根,莖,葉和小穗,結果表明TaBI-1.1的表達在這些小麥組織中普遍存在,而且在葉中最高,在小穗中最低(圖1I)。在SA和NaCl處理之后,成熟葉中的表達與對照相比增加,并且SA處理的表達更高。當SA和NaCl處理時,在下胚軸中也檢測到表達(圖1E,F)。在ABA處理的植物的葉子中檢測到較弱的表達(圖1G)。通過qRT-PCR進一步證實GUS表達水平(圖1H)。以上結果表明,TaBI-1.1在各種脅迫下均有表達。

圖1. 通過qRT-PCR和GUS染色評估TaBI-1.1的相應表達模式

2.TaBI-1.1的表達增強了擬南芥對Pst DC3000感染的抗性
經過Fg和SA處理后表達上調,假設TaBI-1.1可能參與生物脅迫反應。研究人員在擬南芥中異位表達TaBI-1.1,在花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子的控制下驗證這一假設。選擇兩個TaBI-1.1表達水平相對較高的純合株系3和7(35S :: TaBI-1.1#1和35S :: TaBI-1.1#2)用于進一步分析(圖2A)。將atbi1-2,Col-0和兩個轉基因品系的四周齡葉子進行Pst DC3000感染或10mM MgCl 2處理(模擬物)。在模擬實驗中,在用10mM MgCl 2處理3天后,在atbi1-2,Col-0和兩個轉基因品系的葉中沒有觀察到明顯差異(圖2B)。在用600nm(OD600)0.002的光密度接種Pst DC3000,3天后在這些葉中檢測到疾病癥狀。 atbi1-2突變體表現出的癥狀較嚴重,因為幾乎所有的葉片都表現出嚴重的萎黃和壞死,而兩種轉基因品系表現出比atbi1-2和Col-0更輕微的疾病癥狀。轉基因植物的一小部分葉子是綠色的,沒有表現出萎黃和壞死。 Col-0葉中疾病癥狀的程度介于atbi1-2和兩個轉基因品系之間(圖2C)。在接種Pst DC3000或10mM MgCl 2(模擬物)后24小時監測SA水平。在模擬組中,在35S :: TaBI-1.1#1中觀察到最高的SA水平,且顯著高于Col-0。在Pst DC3000處理下,與Col-0相比,在兩個轉基因品系中檢測到顯著較高的SA水平,并且在四種基因型中35S :: TaBI-1.1#1含有最高的SA水平。 Col-0和atbi1-2之間的差異也達到了顯著水平(圖2D)。在0和3dpi時測量 atbi1-2,Col-0和兩個轉基因品系的葉片中的細菌滴度。在初始接種量(0dpi)中,在四種基因型中沒有觀察到致病細菌生長的顯著差異。在3dpi時,兩種轉基因品系的細菌滴度明顯低于Col-0,Col-0的細菌滴度也明顯低于atbi1-2,表明兩種轉基因品系對致病細菌的生長有較強的抑制作用,并且atbi1-2比Col-0更容易感染病原菌(圖2E)?;諏礁鱟蛑晗抵薪細咚降?5S :: TaBI-1.1#1,使用35S :: TaBI-1.1#1來進一步檢測PR1的表達。高SA水平誘導PR基因的表達以增強植物對病原體攻擊的抗性。 PR1表達的增加或許可以解釋對Pst感染抵抗力的增強(圖2F)。

圖2. TaBI-1.1轉基因擬南芥對Pst DC3000的抗性增強

3.TaBI-1.1正向調節的SA相關基因表達
PR基因表達與SA積累和系統獲得性抗性(SAR)有關。進一步檢測了常規條件下生長2周齡Col-0,atbi1-2和35S :: TaBI-1.1#1幼苗中SA相關基因的表達。與Col-0和atbi1-2相比,在35S :: TaBI-1.1中觀察到PR1,PR5,ICS1和EDS1有顯著高表達水平。 然而,在這些基因表達水平中Col-0和atbi1-2之間沒有檢測到顯著差異(圖3)。 與Col-0相比,35S :: TaBI-1.1中PR1和PR5的表達水平分別增加了約11倍和9倍。 PR2,ICS1和EDS1表達的倍數變化低于PR1和PR5表達的變化(圖3)。因此,TaBI-1.1上調PR1,PR2,PR5,ICS1和EDS1基因的表達,表明 TaBI-1.1在SA信號傳導中起正向調節作用。

圖3. 通過qRT-PCR檢測正常條件下生長的atbi1-2,Col-0和35S :: TaB1-1.1 2周齡幼苗中5個SA相關基因的表達水平。

4.TaBI-1.1降低了SA和ABA的敏感性
將Col-0,atbi1-2和35S :: TaBI-1.1的4日齡幼苗置于含有不同濃度SA,NaCl和ABA的MS培養基中,以研究Col- 0,atbi1-2和35S :: TaBI-1.1轉基因擬南芥植株在苗期響應SA和其他脅迫處理的不同表型。 13天后監測到形態學變化。在沒有生長調節劑的MS培養基上(MS0),在任何兩種基因型的Col-0,atbi1-2和兩種35S :: TaBI-1.1轉基因品系之間沒有觀察到顯著差異的根長,側根或鮮重(圖4A,E-G)。在補充有30μMSA的MS培養基上,atbi1-2與Col-0在鮮重,根長和側根數量上顯示出較大的差異(圖4H-J)。 35S :: TaBI-1.1#2的側根數也與Col-0的側根數顯著不同(圖4J)。在含有30μMSA的MS培養基上生長的植物中,Col-0的異常生長程度介于atbi1-2和35S :: TaBI-1.1之間(圖4H-J)。高濃度SA會增加H2O2的積累并導致氧化損傷。當置于含有50μMSA的MS培養基上時,幼苗顯示更明顯的生長畸形。這些結果顯示,在SA濃度較高的情況下,幼苗遭受更嚴重的SA脅迫。用高濃度SA處理的葉子比用MS0培養基處理的葉子綠色淺,黃色淡和葉子?。ㄍ?B)。在含有50μMSA的MS培養基上生長的35S :: TaB1-1.1#1的根長顯著長于Col-0(圖4K)。35S :: TaBI-1.1#1的鮮重和側根數與Col-0相比顯著增加(圖4L,M)。因此,SA不僅影響葉子的大小和顏色,而且影響根長,鮮重和側根數。
此外,研究人員檢查了在含有NaCl和ABA的MS培養基上生長的幼苗的表型。 在含有100和120mM NaCl的MS培養基上生長的植物之間沒有觀察到顯著差異(圖4C,N-S)。在用20μMABA處理后,atbi1-2的畸形程度比 Col-0和35S :: TaBI-1.1更明顯(圖4D)。 根據統計學分析,atbi1-2與Col-0相比在根長,鮮重和側根數上顯示出顯著差異,表明atbi1-2對ABA更敏感(圖4T-V)。 然而, 30μMABA處理中未觀察到根長,鮮重或側根數的明顯差異(圖4W-Y)。 因此,TaBI-1.1轉基因擬南芥對高濃度SA表現出降低的敏感性,并且atbi1-2突變體對ABA表現出增加的敏感性。

圖4. 在含有SA,NaCl或ABA的MS培養基上生長的atbi1-2,Col-0和35S :: TaB-1.1幼苗根長,鮮重和側根數的統計分析。

研究者進一步研究了TaBI-1.1在發芽過程中對ABA的敏感性。 在不同濃度的ABA的培養基上每12小時記錄發芽種子的百分比。在MS0培養基中,Col-0,atbi1-2和35S :: TaBI-1.1轉基因擬南芥植物顯示相似的發芽率(圖5A)。 含有0.5μMABA的培養基中,兩種轉基因株系萌發顯著快于Col-0和atbi1-2(圖5B)。 在含有1μMABA的培養基上觀察不到顯著差異(圖5C)。 在含有2μMABA的培養基上,Col-0和兩種轉基因品系也比atbi1-2稍快地萌發(圖5D)。 以上結果表明,TaBI-1.1轉基因擬南芥對ABA的敏感性較低。

圖5. TaBI-1.1轉基因擬南芥在萌發過程中對ABA的敏感性降低。

5.擬南芥RNA-Seq分析中TaBI-1.1的表達
研究人員對35S :: TaBI-1.1#1和Col-0植物進行了RNA-seq分析,以更好地理解TaBI-1.1功能。鑒定出48個上調基因和58個下調基因并做了一個熱圖。使用GO分析將差異表達的基因功能分類。富集了30多個GO terms,如圖6所示。對于上調的基因,富集的GO terms主要集中在抗生物脅迫,細胞免疫應答和SA合成與代謝相關的生物過程上。前10個關鍵的Go terms分別是防御反應、對外部刺激的反應、對生物刺激的反應、對外部生物刺激的反應、多生物體過程、對另一個生物體的反應、對另一個生物體的防御反應、對壓力的反應、單一生物體代謝過程和對化學物質的反應(圖6A)。對于下調的基因,富集的GO terms集中在細胞組分上,并且前三項是細胞組分,膜和細胞周圍(圖6B)。選擇七個上調基因和三個下調基因進行qRT-PCR實驗,結果表明,qRT-PCR結果與RNA-seq分析一致。

圖6. 使用RNA-seq分析GO terms在35S :: TaBI-1.1和Col-0之間差異表達的基因的富集

KEGG富集分析差異表達基因被呈現為散點圖。 使用富集因子、q值和通路中富集的基因數量來測量富集程度。 富集因子越高表示富集程度越高。觀察到上調基因富集了20多個KEGG通路。上調基因的前20個富集通路中,其中光合作用是最明顯的富集途徑(圖7A)。 光合作用的富集因子達到0.09,而q值大約為0。相反,下調基因的KEGG富集通路并不明顯,只有6個富集因子較低的通路被鑒定出來(圖7B)。因此,TaBI-1.1參與對生物脅迫的應答并主要通過基因上調表達來執行其防御功能。

圖7. 35S :: TaBI-1.1和Col-0差異表達基因的KEGG富集分析

6.TaBI-1.1與TaPIP1相互作用并在ER膜上與TaPIP1共定位
將TaBI-1.1置于PGBKT7(BD)載體中,用作誘導蛋白在酵母雙雜交實驗中篩選小麥cDNA文庫,以進一步探索TaBI-1.1調節應激反應的細胞機制。 結果,鑒定出一個候選的相互作用物質,水通道蛋白TaPIP1。 使用酵母雙雜交和pull-down測定來確定TaBI-1.1和TaPIP1之間在體內和體外的相互作用。將融合TaBI-1.1(BD-TaBI-1.1)的BD載體和融合TaPIP1(AD-TaPIP1)的pGADT7(AD)載體轉化到酵母細胞中。只有用BD-TaBI-1.1和AD-TaPIP1轉化的酵母細胞能夠在缺乏Trp,Leu,His和Ade(SD / -Trp-Leu-Ade-His)的選擇性培養基上生長。轉換TaBI-1.1和TaPIP1的融合載體產生相同的結果,表明TaBI-1.1與TaPIP1在酵母細胞中有相互作用(圖8A)。使用pull-down分析進一步確認相互作用(圖8B)。將TaBI-1.1克隆到pCold TM TF表達載體中在大腸桿菌中產生重組蛋白TF-His-TaBI-1.1。通過將序列克隆到pGEX-4T-1載體中,在大腸桿菌中成功產生了重組GST(谷胱甘肽S-轉移酶)-TaPIP1蛋白。使用抗His抗體的Western印跡所示,體外pull-down測定顯示TF-His-TaBI-1.1與GST-TaPIP1有物理互作(physically interacted)(圖8B)
AtBI-1定位于ER膜上,研究者在小麥原生質體中檢測了TaBI-1.1-GFP和mRFP-HDEL的共定位以確定TaBI-1.1的亞細胞定位。GFP和mRFP熒光的重疊系數 是0.69,表明TaBI-1.1與ER膜上的HDEL共定位(圖8C)。 鑒于TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用,研究者還檢測到TaPIP1-GFP和mRFP-HDEL之間的共定位以及TaBI-1.1-GFP和TaPIP1-mRFP在小麥原生質體中的共定位(圖8C)。 結果顯示TaBI-1.1和TaPIP1共定位于ER膜。
通過qRT-PCR檢測響應多次處理的TaPIP1的表達水平。 SA,NaCl和ABA處理使TaPIP1表達上調,這意味著TaPIP1可能參與對生物和非生物脅迫的反應(圖8D)。

圖8. TaBI-1.1和TaPIP1的相互作用和亞細胞定位

7.TaPIP1增加了擬南芥對PstDC3000感染的抗性
為了進一步研究TaBI-1.1和TaPIP1之間相互作用的潛在功能,研究人員構建了一個在 CaMV 35S啟動子控制下表達TaPIP1的轉基因擬南芥。選擇了兩個獨立的轉基因品系: 35S :: TaPIP1-1和35S :: TaPIP1-2,且TaPIP1的表達水平較高,這通過qRT-PCR分析進行了驗證(圖9A)。鑒于SA處理下TaPIP1水平的上調,推測TaPIP1也可能參與對病原體感染的響應。為了驗證這個想法,研究者在Pst DC3000感染下檢測了TaPIP1轉基因擬南芥的葉表型。在模擬處理下,Col-0和兩個轉基因品系的葉片中沒有觀察到差異(圖9B)。在用Pst DC3000接種后,發現Col-0葉片上明顯的褪綠癥狀,相反,兩種轉基因植物的褪綠癥狀較輕(圖9C)。為了進一步證實TaPIP1轉基因擬南芥中的抗性增加,在0和3dpi測量葉片中的細菌滴度。如圖9D所示,在初始接種量中Col-0和兩個轉基因品系之間沒有顯著差異,但是在3dpi時兩個TaPIP1轉基因擬南芥中的Col-0的細菌滴度顯著低于Col-0,表明TaPIP1轉基因擬南芥中病原菌的生長受到很大抑制。因此,TaBI-1.1和TaPIP1在響應Pst DC3000感染時表現出類似的作用,并且研究者推測TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用可能涉及防御反應。

圖9. TaPIP1轉基因擬南芥對Pst DC3000表現出增強的抗性

創新點:

BI-1是一種局限于內質網(ER)膜的細胞?;さ鞍?,在對生物和非生物脅迫的應答中發揮重要作用。迄今為止,雖然已經鑒定了幾種與BI-1相互作用的蛋白質。然而,關于BI-1在內質網應激中機制的認知非常有限,BI-1調節植物內質網應激反應的機制目前尚不清楚,該研究中,通過禾谷鐮刀菌(Fg)處理的小麥的RNA-seq數據分析確定了小麥BI-1基因TaBI-1.1,揭示了TaBI-1.1和TaPIP1在響應病原體感染的ER膜上的相互作用的可能作用。

參考文獻:
Lu P P, Yu T F, Zheng W J, et al. The Wheat Bax Inhibitor-1 Protein Interacts with an Aquaporin TaPIP1 and Enhances Disease Resistance in Arabidopsis[J]. Front Plant Sci, 2018, 9:20.

 

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